Rata de laboratorio: Fábrica de proteínas

Un guiño a cuatro juegos del ZX Spectrum. Millionaire (John Hunt, Incentive Software, 1984) te ponía a escribir y vender juegos desde tu cuarto con 500 libras: repartías 20 puntos entre programación, presentación, ideas originales e interés para el jugador, mirabas las ventas cada mes, y Honest Harry ofrecía negocios que podían ser gangas o líos. Cookie (Ultimate Play the Game, 1983) tenía a Charlie, el cocinero, mandando ingredientes fugitivos a un cuenco mientras un monstruo de la basura echaba porquería dentro. Aquí empiezas el doctorado: los 20 puntos van a las etapas de poyata en las que te gustaría tener ayuda, el mes acaba con un informe, tu rincón de una poyata compartida acaba siendo el mejor sitio del laboratorio, y los vendedores (Toño de las Puntas y compañía) son primos de Honest Harry. El medio de cultivo es el cuenco. Y como en Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985), el juego de submarinos detrás de Beamline Commander, te mueves entre las salas del laboratorio (poyata, despacho, catálogo, biblioteca, cocina) como un capitán entre los puestos de un submarino. La jefatura de grupo añade Football Manager (Kevin Toms, Addictive Games, 1982): una plantilla con valoraciones y energía, cambios al final de cada temporada, fichajes y cuentas que cuadrar. Aquí la plantilla es tu laboratorio, y no se vende ni se despide a nadie.

Termina el doctorado (cristales entregados, en cualquier nivel) y se abre el postdoc: un laboratorio mejor equipado en una universidad mejor (un instituto puntero, después de un doctorado brillante), un contrato de tres años y una proteína de membrana. Acaba con una entrevista para una plaza de profesorado: con cristales y un artículo tuyo llegas ante el tribunal (en Medio, después de dos proteínas de postdoc; en Difícil, de tres), y las respuestas correctas te dan la plaza. Cada etapa terminada queda en tu historial; otro doctorado, o el postdoc, empieza con los trucos que aprendiste y los libros que leíste, nunca con el material. Termina un postdoc y se abre la jefatura de grupo: cinco años con tu propio laboratorio en un instituto de nombre sospechosamente familiar, un paquete de arranque que depende de cómo fue el postdoc (quizá dirigiendo el departamento), y un equipo que montar. Cada persona tiene nueve puntos fuertes (creatividad, ideas nuevas, mano en la poyata, análisis, escritura, resolución, docencia, trabajo en equipo, comunicación), cada uno con su propio techo (nadie se convierte en superhéroe), y además energía, bienestar, concentración y un vínculo con el laboratorio. Contratas con anuncios o fichas estrellas emergentes de laboratorios rivales, pones a la gente en los proyectos que encajan con sus puntos fuertes, tienes charlas a solas con regularidad (sin ellas, la gente se descentra; con ellas, se queda, aunque un rival ofrezca más), emparejas a doctorandos con mentores de carácter compatible, haces promesas que más te vale cumplir, negocias sueldos al renovar, lees el informe mensual de la gerencia del laboratorio, mandas a la gente a cursos y aplaudes cuando se van a puestos mejores. Rico Mbinante vende redactores de solicitudes «garantizados» y contratos de mantenimiento baratos, y Pepe Tapagujeros manda doctorandos y postdocs a precio de saldo, sin verlos antes. Las ayudas pagan los sueldos, las charlas invitadas se convierten en conferencias de apertura, y vienen a buscarte institutos más imponentes. Cada año la junta del instituto fija objetivos (artículos, ayudas, entregas a las líneas de luz, un equipo a gusto), y al final de los cinco años un comité de evaluación los revisa: una nota suficiente (y un artículo) te deja seguir con el laboratorio; si se cumplen pocos objetivos, o pasas tres meses hasta el cuello de deudas, cierra. Las ideas de proyectos vienen de tu equipo, de la gente que conoces, de antiguos miembros del laboratorio y de las máquinas nuevas, y algunas llegan con un rival que te echa una carrera hasta el artículo. Los proyectos necesitan el material adecuado (sin él, el equipo lo pide prestado, despacio), y un microscopio confocal o una medida de unión puede llevar un artículo a una revista de primera. Cada semana eliges un plan: la poyata con el equipo (un momento práctico tuyo), una semana de escritura, reuniones, o la carta de la semana (un seminario, un tribunal de ayudas, Contabilidad). Una vez en cinco años algo grande sale mal (un recorte, una inundación, una nueva dirección de departamento egoísta, una filtración), y a veces algo grande sale bien. Después de cada charla, en el postdoc o al frente del grupo, llega el turno de preguntas (una fácil, una media y una difícil), y luego la cena del congreso, donde una noche larga en la barra puede enseñarte un secreto, costarte uno o acabar en romance. Tú eliges quién es tu rata de laboratorio: ella, él o neutro (sin palabras con género).

Como en un laboratorio de verdad, un doctorando no lleva las ayudas grandes: ayudas a tu directora de tesis a escribir las suyas (una parte llega a tu proyecto) y a un postdoc con una solicitud de equipamiento (la máquina que traiga también la puedes usar), y de vez en cuando alguien más del doctorado te pide una mano, y eso puede acabar en un artículo con tu nombre. Los laboratorios también son personas: una mala racha, un flechazo en el laboratorio, una discusión por un sitio en la poyata, un error que nadie vio. Hablar con alguien, pedir las cosas con buenos modos y reconocer los errores siempre ayuda, y la biblioteca tiene un libro (un poco tonto) para cada caso.

En el doctorado se llevan pósteres a los congresos (uno bueno puede ganar el premio); en el postdoc se dan charlas cortas, se escriben más artículos, se entra en la asociación de postdocs, y se puede pagar a un técnico un par de meses cuando falta más tiempo que dinero. Las cosas pequeñas se acaban (geles prefabricados, células competentes de las buenas, suplementos de autoinducción), así que vigila la balda. Los niveles más difíciles valen más: la reputación llega más rápido y los puntos finales cuentan más. En el postdoc también puedes probar rejillas de crio-EM y entender por qué una proteína de membrana pequeña es trabajo para los cristales. Los artículos van sumando citas mes a mes (las ventas de Millionaire), una nota de prensa puede conseguir una entrevista en un periódico o en la tele, y las jornadas de puertas abiertas y las actividades sobre profesiones solo cuestan tiempo.

La ciencia

• La proteína. UgpG, de Sphingomonas elodea, la bacteria que fabrica la goma gellan. Une la glucosa-1-fosfato al UTP para hacer UDP-glucosa, una pieza de la goma. Fue la proteína del doctorado de David: clonación, expresión, purificación y cristalización (Acta Crystallographica F, 2006) y su estructura (Journal of Bacteriology, 2007).

• La clonación. Una PCR copia el gen, unas enzimas de restricción lo cortan, igual que a un vector, y el nuevo plásmido entra en E. coli. Las colonias que crecen con ampicilina lo llevan, salvo las diminutas colonias satélite de alrededor, que viven donde la colonia grande ha destruido el antibiótico. El plásmido se recupera con una miniprep (antes, con fenol-cloroformo) y se secuencia.

• El cultivo y la expresión. El medio LB (triptona, extracto de levadura, sal) va al autoclave; después, los bichos solo pueden entrar de fuera. La curva de crecimiento tiene una fase de latencia, una fase exponencial y una meseta, y el IPTG enciende el gen a través del operón lac. Si se fabrica demasiado deprisa, la proteína se pliega mal y acaba en cuerpos de inclusión.

• La purificación. Las columnas separan las proteínas por su carga (intercambio iónico), por lo grasientas que son (interacción hidrofóbica, uno de los tipos de cromatografía), por su tamaño (exclusión molecular) o por una cola de histidinas sobre níquel. El método de Bradford enseña dónde hay proteína, cualquiera; el SDS-PAGE enseña qué banda es la tuya.

• Antes de los cristales. La dispersión dinámica de luz detecta agregados, y un ensayo de desplazamiento térmico encuentra el tampón que le gusta a la proteína.

• Los cristales. La cristalización de proteínas por difusión de vapor: cribados de condiciones, hits, optimización, y la congelación con un crioprotector para la línea de luz. La selenometionina en lugar de la metionina añade una señal que ayuda a resolver la estructura, y una serie cuidadosa de concentraciones en un tampón a juego da una muestra para SAXS.

• La proteína del postdoc. AlgE, el poro de la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa por el que sale el alginato de sus biofilms: un barril beta en la membrana externa de las bacterias. Es una proteína de membrana, grasienta donde toca los lípidos, y los dos caminos del juego están publicados. El replegamiento: AlgE fabricada en cuerpos de inclusión, desplegada en urea y replegada en detergente, y luego cristalizada en detergente (el método: Whitney et al., Acta Crystallographica F, 2009; la estructura: Whitney et al., PNAS, 2011). Las membranas: células cultivadas en frío, las membranas sedimentadas en una ultracentrifugadora, AlgE extraída con un detergente suave, el octilglucósido, cambiado por LDAO en una columna de cobre, y cristalizada en la fase cúbica lipídica, primero en monooleína y mejor en un lípido más corto, el 7.8 MAG (Tan et al., Acta Crystallographica D, 2014; el método: Caffrey y Cherezov, Nature Protocols, 2009). El gen entra por clonación TOPO. David ayudó a recoger y procesar los datos de las estructuras de 2014, a refinarlas y a resolver la estructura: mira AlgE.

• La otra proteína del postdoc. DgkA, una diacilglicerol quinasa de la membrana interna de E. coli: 121 aminoácidos, tres cadenas que trabajan juntas y pasan un fosfato del ATP a un lípido. Su camino en el juego es el publicado: el gen hecho por encargo en el vector pTrcHisB, mutaciones estabilizadoras (el Δ4 termoestable y el Δ7 diseñado), el lisado de las células solubilizado en el detergente Empigen BB y cambiado a decil maltósido en una columna de níquel, y por fin cristales en la fase cúbica lipídica con 7.8 MAG a 4 °C, que tardaron semanas en crecer (Li et al., Nature, 2013). El reemplazo molecular falló, así que las fases salieron de la selenometionina. Más tarde, un empapado con un análogo de ATP no hidrolizable y zinc la pilló a mitad de reacción (Li et al., Nature Communications, 2015). David formó parte del equipo de los dos artículos, en la parte de cristalografía: mira DgkA.

• Los receptores del postdoc. Dos receptores acoplados a proteínas G (GPCR), la familia detrás del Premio Nobel de Química de 2012 de Robert Lefkowitz y Brian Kobilka: siete hélices que cruzan la membrana, un bolsillo para el fármaco que cambia de forma, y bucles flojos que complican los cristales. Los dos se producen en células de insecto (Sf9) infectadas con un baculovirus que lleva el gen. El receptor adrenérgico β2 sigue el artículo de 2011: lisozima del fago T4 metida en su tercer bucle, el flojo, el cambio H93C para que un agonista diseñado se agarre para siempre, una columna de anticuerpo y una columna de alprenolol, y luego cristales minúsculos en monooleína con colesterol (Rosenbaum et al., Nature, 2011); con el carazolol, un agonista inverso, repites una estructura anterior. David es uno de los autores del artículo de 2011: mira β2AR. El receptor adrenérgico β1 del pavo se hace antes más robusto: un escaneo de alanina de 318 mutantes en E. coli, cada uno calentado y probado para ver si aún unía un fármaco, y los seis mejores juntos, 21 °C más estable (Serrano-Vega et al., PNAS, 2008); luego células de insecto y cristales en detergente por difusión de vapor (Warne et al., Nature, 2008), el trabajo de los grupos de Chris Tate y Gebhard Schertler en el MRC Laboratory of Molecular Biology.

• Los proyectos al frente del grupo. KcsA, el canal de potasio bacteriano cuya estructura (Doyle et al., Science, 1998) ayudó a Roderick MacKinnon a ganar el Premio Nobel de Química de 2003; la IL-33 atrapada por la proteína de un gusano intestinal, HpARI2, producidas en dos hospedadores y estudiadas con cristales y SAXS (Jamwal et al., Nature Communications, 2024); PTX3, el proyecto estrella, con cristales, crio-EM y SAXS (Shah et al., Matrix Biology, 2025); y un cribado de fragmentos, cientos de cristales empapados para la I04.

• Los proyectos grandes, más adelante en los cinco años: los venenos de los animales peligrosos de Australia, entre ellos el péptido de una araña de tela en embudo que protege el cerebro tras un ictus en ratas (Chassagnon et al., PNAS, 2017); una PETasa más rápida, la enzima comeplásticos estudiada en las líneas de MX de Diamond: su estructura en la I23, la I03 y la I04 (Austin et al., PNAS, 2018), la «superenzima» PETasa–MHETasa en la I03 (Knott et al., PNAS, 2020) y la HotPETasa, evolucionada para trabajar a 70 °C, en la I03, la I04 y la I04-1 (Bell et al., Nature Catalysis, 2022); enzimas contra las mareas negras; un fármaco contra los temibles henipavirus; que los antibióticos vuelvan a funcionar frente a las betalactamasas y las bombas; fármacos contra el cáncer y la gripe diseñados a partir de estructuras, como el venetoclax y el oseltamivir (Tamiflu); y enzimas que hacen química en agua, a temperatura ambiente.

• El material del grupo. Como el de un laboratorio de proteínas de membrana: una sala de células de insecto, un robot de LCP y el LCP-FRAP (se fotoblanquea un punto de proteína fluorescente en la fase cúbica: si vuelve a brillar, la proteína puede cristalizar ahí), la FSEC, un congelador por inmersión y un robot de rejillas para la crio-EM, la expresión libre de células para las proteínas que matan a su hospedador; y para el artículo, un microscopio confocal (adónde va la proteína en la célula), la SPR (con qué fuerza se une) y la fotometría de masas (cuántas copias se pegan entre sí).

• Abrir las placas. Los cristales en fase cúbica lipídica crecen sellados entre dos láminas de vidrio. Para cosecharlos se rayan dos círculos en el cubreobjetos alrededor del pocillo, se rompe el vidrio entre ellos y se levanta el disco con unas pinzas; los cristales se pescan de la mesofase pegajosa con un lazo pequeño y van directos al nitrógeno líquido, sin crioprotector (Li, Boland, Aragão, Walsh y Caffrey, JoVE, 2012, un protocolo en vídeo).

Donde el juego hace un poco de trampa

• La etiqueta. Empiezas con la proteína nativa y tres columnas, y la cola de histidinas te la ganas más tarde. La UgpG de verdad tenía cola de histidinas desde el principio: una columna de níquel y una de desalado, y el Bradford para medirla.
• Los sitios de restricción. La UgpG de verdad se clonó con BamHI y HindIII; los motivos del juego para no usar EcoRI o NotI son inventados.
• La carga de UgpG. La pista del juego sobre qué columna de intercambio iónico usar sale de un pI inventado para el juego, no de uno medido.
• Precios y tiempos. Los precios del material, las cantidades de las ayudas y casi todos los tiempos son números redondos de juego. El material de verdad es más caro, y las ayudas de verdad tardan más.
• La luz polarizada. En el juego, los cristales de sal se iluminan y los de proteína casi nada. La realidad es menos ordenada: muchos cristales de proteína también brillan entre polarizadores cruzados, y los cristales de sal cúbicos no.
• La optimización. Emparejar un método con un tipo de cristal funciona aquí mucho más limpio que en una poyata de verdad, donde los cristalógrafos lo prueban casi todo y tienen el cuaderno siempre a mano.
• La autoinducción. Los medios de autoinducción de verdad (las recetas de F. William Studier) son más ricos que el LB con tres azúcares encima; el juego se queda con el LB y añade los azúcares en un solo bote.
• Las rejillas. La revisión de rejillas de verdad mira cientos de cuadrados y luego los agujeros de dentro; el juego enseña un solo atlas y cuatro elecciones. Desde entonces se han resuelto proteínas pequeñas por crio-EM, con trucos (fusiones, fragmentos de anticuerpo).
• El replegamiento. Como en el artículo de 2009, AlgE pasa a urea 8 M y se añade gota a gota a un tampón con detergente, pero el artículo antes pasaba una columna de níquel en urea, y luego agitaba las gotas toda la noche a 37 °C: replegar de verdad lleva una noche, no medio minuto.
• Los detergentes. El juego ofrece tres y uno es el bueno. Los laboratorios de verdad criban muchos, y el Triton X-100 tiene sus fans.
• La fase cúbica. Mezclar de verdad lleva unos cien pasos; el juego cuenta un par de docenas. Además, sus jeringas se calientan mucho más rápido que las de verdad, para que el hielo tenga su momento. El lado frío es real: por debajo de unos 18 °C la monooleína se va volviendo cerosa, que es una de las razones por las que las placas de DgkA en la cámara fría usaban un lípido más corto, el 7.8 MAG.
• Abrir las placas. Un pocillo de verdad tarda más de medio minuto en abrirse, y un cortavidrios se desafila después de unos diez.
• Los genes y el tiempo de DgkA. En el juego los genes llegan ya en el vector; el artículo dice que se hicieron por encargo y se clonaron en él, sin decir quién. Sus cristales tardaron de 45 a 60 días en la cámara fría; el juego lo deja en unas seis semanas.
• Membranas o cuerpos de inclusión. Cuánta AlgE va a cada sitio a cada temperatura es un número de juego.
• Los receptores. El artículo del β2AR fue una colaboración entre varios laboratorios, entre ellos los de Brian Kobilka y Martin Caffrey; en el juego haces tú cada paso. El barrido tiene 40 pocillos en lugar de 318, y el fármaco radiactivo se ve como un brillo. Los recuentos de células, la infección y los días de cosecha son números de juego: los métodos de los artículos no los dan. Las células Sf9 de verdad tardan más o menos un día en duplicarse, más despacio que en el juego.
• El laboratorio del grupo. Los institutos, los jefes de grupo rivales y el equipo son inventados, y sus nombres son bromas. Los proyectos avanzan por semanas de trabajo repartidas entre quienes están en ellos, que es algo muy lejano a cómo avanza de verdad la ciencia, y las ayudas se deciden mucho más rápido que las de verdad. Las ideas de proyectos (la enzima favorita de un calcetín que huele mal, la masa madre inmortal del laboratorio) son sobre todo para pasarlo bien, y una máquina no hace de verdad que un artículo sea el doble de famoso. Que te pisen el artículo pasa, pero rara vez por una sola noche larga en la barra de un congreso.