Rat de labo : Usine à protéines

Un clin d’œil à quatre jeux du ZX Spectrum. Millionaire (John Hunt, Incentive Software, 1984) te faisait écrire et vendre des jeux depuis ta chambre avec 500 livres : on répartissait 20 points entre programmation, présentation, idées originales et intérêt pour le joueur, on suivait les ventes chaque mois, et Honest Harry proposait des affaires qui étaient soit des bonnes affaires, soit des ennuis. Cookie (Ultimate Play the Game, 1983) faisait courir Charlie le chef derrière des ingrédients en fuite pour les envoyer dans un saladier, pendant qu’un monstre de poubelle y jetait des ordures. Ici, tu commences une thèse : les 20 points vont aux étapes de paillasse où tu aimerais de l’aide, le mois se termine par un bilan, ton coin de paillasse partagée devient peu à peu la meilleure travée du labo, et les vendeurs (Coco des Cônes et compagnie) sont des cousins de Honest Harry. Le milieu de culture, c’est le saladier. Et comme dans Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985), le jeu de sous-marin derrière Beamline Commander, tu passes d’une salle du labo à l’autre (paillasse, bureau, catalogue, bibliothèque, cuisine) comme un commandant entre les postes d’un sous-marin. Le parcours de chef d’équipe ajoute Football Manager (Kevin Toms, Addictive Games, 1982) : un effectif avec des notes et de l’énergie, des changements à chaque fin de saison, le mercato et les comptes à équilibrer. Ici, l’effectif, c’est ton labo, et personne n’est vendu ni viré.

Termine la thèse (des cristaux livrés, à n’importe quel niveau) et le postdoc s’ouvre : un labo mieux équipé dans une meilleure université (un institut de pointe après une thèse brillante), un contrat de trois ans et une protéine membranaire. Il se termine par une audition pour un poste de maître de conférences : des cristaux et un article à toi te mènent devant le jury (en Moyen, après deux protéines de postdoc ; en Difficile, trois), et les bonnes réponses te valent le poste. Chaque parcours terminé reste dans ton dossier ; une autre thèse, ou le postdoc, commence avec les astuces apprises et les livres lus, jamais le matériel. Termine un postdoc et le parcours de chef d’équipe s’ouvre : cinq ans avec ton propre labo dans un institut au nom curieusement familier, un budget de démarrage qui dépend de ton postdoc (peut-être avec la direction du département), et une équipe à construire. Chaque personne a neuf points forts (créativité, idées nouvelles, doigté à la paillasse, analyse, écriture, efficacité, pédagogie, travail d’équipe, communication), chacun avec son propre plafond (personne ne devient un super-héros), plus l’énergie, le bien-être, la concentration et les liens avec le labo. Tu recrutes par des offres ou tu attires des étoiles montantes des labos rivaux, tu mets les gens sur les projets qui collent à leurs points forts, tu fais des points réguliers en tête-à-tête (sans eux, les gens décrochent ; avec eux, ils restent, même quand un rival offre plus), tu associes les doctorants à des mentors dont le caractère s’accorde au leur, tu fais des promesses que tu as intérêt à tenir, tu discutes salaire au renouvellement, tu lis le rapport mensuel de la gestion du labo, tu envoies les gens en formation, et tu applaudis quand ils partent vers de plus grands postes. Rico Mbinant vend des rédacteurs de demandes « garantis » et des contrats de maintenance pas chers, et Gérard Bouchetrou envoie des doctorants et des postdocs à prix cassé, sans les voir. Les financements paient les salaires, les exposés invités deviennent des conférences d’ouverture, et des instituts plus prestigieux viennent te chercher. Chaque année, le conseil de l’institut fixe des objectifs (articles, financements, livraisons aux lignes de lumière, une équipe heureuse), et au bout des cinq ans un comité d’évaluation les examine : une note suffisante (et un article) te fait garder ton labo ; trop peu d’objectifs atteints, ou trois mois criblés de dettes, et il ferme. Les idées de projets viennent de ton équipe, des gens que tu rencontres, d’anciens membres du labo et des nouvelles machines, et certaines arrivent avec un rival qui fait la course avec toi jusqu’à l’article. Les projets ont besoin du bon matériel (sans lui, l’équipe emprunte, lentement), et un microscope confocal ou une mesure de liaison peut faire monter un article dans une grande revue. Chaque semaine, tu choisis un programme : la paillasse avec l’équipe (un moment pratique à toi), une semaine d’écriture, des réunions, ou la carte de la semaine (un séminaire, un jury de financement, le service financier). Une fois en cinq ans, quelque chose de grave arrive (une coupe budgétaire, un dégât des eaux, une nouvelle direction de département égoïste, une fuite), et parfois quelque chose de formidable. Après chaque exposé, en postdoc ou à la tête d’une équipe, viennent les questions de la salle (une facile, une moyenne et une difficile), puis le dîner du congrès, où une longue soirée au bar peut t’apprendre un secret, t’en coûter un, ou finir en histoire d’amour. Tu choisis qui est ton rat de labo : elle, il ou neutre (sans mots genrés).

Comme dans un vrai labo, un doctorant ne porte pas les gros financements : tu aides ta directrice de thèse à écrire les siens (une part revient à ton projet) et un postdoc avec une demande d’équipement (la machine qu’elle apporte, tu peux t’en servir aussi), et de temps en temps quelqu’un d’autre en thèse te demande un coup de main, ce qui peut finir par un article avec ton nom dessus. Un labo, ce sont aussi des gens : un coup de moins bien, un béguin au labo, une dispute pour une place à la paillasse, une erreur que personne n’a vue. En parler, demander gentiment et reconnaître ses torts, ça aide toujours, et la bibliothèque a un livre (un peu idiot) pour chaque cas.

En thèse, on présente des posters aux congrès (un bon poster peut gagner le prix) ; en postdoc, on fait des exposés courts, on écrit plus d’articles, on rejoint l’association des postdocs, et on peut payer un technicien pendant deux mois quand le temps manque plus que l’argent. Les petites choses s’épuisent (gels précoulés, bonnes cellules compétentes, suppléments d’autoinduction), alors garde un œil sur l’étagère. Les niveaux plus durs rapportent plus : la réputation vient plus vite et le score final compte davantage. En postdoc, tu peux aussi essayer des grilles de cryo-EM, et comprendre pourquoi une petite protéine membranaire, c’est un travail pour les cristaux. Les articles accumulent des citations mois après mois (les ventes de Millionaire), un communiqué de presse peut décrocher une interview dans un journal ou à la télé, et les portes ouvertes et les événements sur les métiers ne coûtent que du temps.

La science

• La protéine. UgpG, de Sphingomonas elodea, la bactérie qui fabrique la gomme gellane. Elle relie le glucose-1-phosphate à l’UTP pour faire de l’UDP-glucose, une brique de la gomme. C’était la protéine de thèse de David : clonage, expression, purification et cristallisation (Acta Crystallographica F, 2006) et sa structure (Journal of Bacteriology, 2007).

• Le clonage. Une PCR copie le gène, des enzymes de restriction le coupent, ainsi qu’un vecteur, et le nouveau plasmide entre dans E. coli. Les colonies qui poussent sur ampicilline le portent, sauf les minuscules colonies satellites autour, qui vivent là où la grosse colonie a détruit l’antibiotique. On récupère le plasmide par une miniprep (autrefois au phénol-chloroforme) et on le fait séquencer.

• La culture et l’expression. Le milieu LB (tryptone, extrait de levure, sel) passe à l’autoclave ; ensuite, les microbes ne peuvent venir que de l’extérieur. La courbe de croissance a une phase de latence, une phase exponentielle et un plateau, et l’IPTG allume le gène grâce à l’opéron lactose. Fabriquée trop vite, la protéine se replie mal et finit en corps d’inclusion.

• La purification. Les colonnes trient les protéines par leur charge (échange d’ions), par leur côté gras (interaction hydrophobe, l’une des sortes de chromatographie), par leur taille (exclusion stérique) ou par une étiquette histidine sur nickel. La méthode de Bradford montre où il y a de la protéine, n’importe laquelle ; le SDS-PAGE montre quelle bande est la tienne.

• Avant les cristaux. La diffusion dynamique de la lumière repère les agrégats, et un thermal shift assay trouve le tampon que la protéine aime.

• Les cristaux. La cristallisation des protéines par diffusion de vapeur : des criblages de conditions, des hits, l’optimisation, puis la congélation avec un cryoprotecteur pour la ligne de lumière. La sélénométhionine à la place de la méthionine ajoute un signal qui aide à résoudre la structure, et une série soignée de concentrations dans un tampon bien appareillé fait un échantillon pour le SAXS.

• La protéine du postdoc. AlgE, le pore de la membrane externe de Pseudomonas aeruginosa qui laisse sortir l’alginate de ses biofilms : un tonneau bêta dans la membrane externe des bactéries. C’est une protéine membranaire, grasse là où elle touche les lipides, et les deux voies du jeu sont publiées. La renaturation : AlgE produite en corps d’inclusion, dépliée dans l’urée puis repliée dans du détergent, et cristallisée en détergent (la méthode : Whitney et al., Acta Crystallographica F, 2009 ; la structure : Whitney et al., PNAS, 2011). Les membranes : des cellules cultivées au frais, les membranes culottées à l’ultracentrifugeuse, AlgE extraite avec un détergent doux, l’octyl glucoside, remplacé par le LDAO sur une colonne au cuivre, puis cristallisée en phase cubique lipidique, d’abord dans la monooléine et au mieux dans un lipide plus court, la 7.8 MAG (Tan et al., Acta Crystallographica D, 2014 ; la méthode : Caffrey et Cherezov, Nature Protocols, 2009). Le gène entre par clonage TOPO. David a aidé à collecter et traiter les données des structures de 2014, à les affiner et à résoudre la structure : voir AlgE.

• L’autre protéine du postdoc. DgkA, une diacylglycérol kinase de la membrane interne d’E. coli : 121 acides aminés, trois chaînes qui travaillent ensemble, qui posent un phosphate de l’ATP sur un lipide. Sa voie dans le jeu est celle qui a été publiée : le gène fait sur commande dans le vecteur pTrcHisB, des mutations stabilisantes (le Δ4 thermostable et le Δ7 dessiné sur mesure), le lysat des cellules solubilisé dans le détergent Empigen BB puis passé au décyl maltoside sur une colonne de nickel, et enfin des cristaux en phase cubique lipidique avec la 7.8 MAG à 4 °C, qui ont mis des semaines à pousser (Li et al., Nature, 2013). Le remplacement moléculaire a échoué, alors les phases sont venues de la sélénométhionine. Plus tard, un trempage avec un analogue d’ATP non hydrolysable et du zinc l’a saisie en pleine réaction (Li et al., Nature Communications, 2015). David faisait partie de l’équipe derrière les deux articles, côté cristallographie : voir DgkA.

• Les récepteurs du postdoc. Deux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), la famille derrière le prix Nobel de chimie 2012 de Robert Lefkowitz et Brian Kobilka : sept hélices à travers la membrane, une poche à médicament qui change de forme, et des boucles molles qui rendent les cristaux difficiles. Les deux sont produits en cellules d’insecte (Sf9) infectées par un baculovirus qui porte le gène. Le récepteur β2-adrénergique suit l’article de 2011 : le lysozyme du phage T4 placé dans sa troisième boucle, la molle, la mutation H93C pour qu’un agoniste dessiné sur mesure s’accroche pour de bon, une colonne d’anticorps et une colonne d’alprénolol, puis de minuscules cristaux en monooléine avec du cholestérol (Rosenbaum et al., Nature, 2011) ; avec le carazolol, un agoniste inverse, tu refais une structure plus ancienne. David est l’un des auteurs de l’article de 2011 : voir β2AR. Le récepteur β1-adrénergique de la dinde est d’abord rendu plus solide : un balayage à l’alanine de 318 mutants dans E. coli, chacun chauffé puis testé pour sa liaison à un médicament, et les six meilleurs réunis, stables à 21 °C de plus (Serrano-Vega et al., PNAS, 2008) ; puis des cellules d’insecte et des cristaux en détergent par diffusion de vapeur (Warne et al., Nature, 2008), le travail des équipes de Chris Tate et de Gebhard Schertler au MRC Laboratory of Molecular Biology.

• Les projets du chef d’équipe. KcsA, le canal potassique bactérien dont la structure (Doyle et al., Science, 1998) a aidé Roderick MacKinnon à obtenir le prix Nobel de chimie 2003 ; l’IL-33 attrapée par une protéine de ver intestinal, HpARI2, produites dans deux hôtes et étudiées par cristaux et SAXS (Jamwal et al., Nature Communications, 2024) ; PTX3, le projet phare, par cristaux, cryo-EM et SAXS (Shah et al., Matrix Biology, 2025) ; et un criblage de fragments, des centaines de cristaux trempés pour I04.

• Les gros projets, plus tard dans les cinq ans : les venins des animaux dangereux d’Australie, dont le peptide d’une araignée à toile en entonnoir qui protège le cerveau après un AVC chez le rat (Chassagnon et al., PNAS, 2017) ; une PETase plus rapide, l’enzyme mangeuse de plastique étudiée sur les lignes MX de Diamond : sa structure sur I23, I03 et I04 (Austin et al., PNAS, 2018), la « super-enzyme » PETase–MHETase sur I03 (Knott et al., PNAS, 2020) et HotPETase, évoluée pour travailler à 70 °C, sur I03, I04 et I04-1 (Bell et al., Nature Catalysis, 2022) ; des enzymes contre les marées noires ; un médicament contre les redoutables henipavirus ; faire remarcher les antibiotiques face aux bêta-lactamases et aux pompes ; des médicaments contre le cancer et la grippe conçus à partir de structures, comme le vénétoclax et l’oseltamivir (Tamiflu) ; et des enzymes qui font de la chimie dans l’eau, à température ambiante.

• Le matériel du chef d’équipe. Comme celui d’un labo de protéines membranaires : une salle de cellules d’insecte, un robot LCP et le LCP-FRAP (on photoblanchit un point de protéine fluorescente dans la phase cubique : si la fluorescence revient, la protéine peut y cristalliser), la FSEC, un appareil de congélation et un robot à grilles pour la cryo-EM, l’expression acellulaire pour les protéines qui tuent leur hôte ; et pour l’article, un microscope confocal (où va la protéine dans la cellule), la SPR (à quel point elle se lie fort) et la photométrie de masse (combien de copies se collent ensemble).

• Ouvrir les plaques. Les cristaux en phase cubique lipidique poussent scellés entre deux lames de verre. Pour les récolter, on raye deux cercles dans la lamelle autour du puits, on casse le verre entre les deux et on soulève le disque à la pince ; on pêche les cristaux dans la mésophase collante avec une petite boucle, et ils vont directement dans l’azote liquide, sans cryoprotecteur (Li, Boland, Aragão, Walsh et Caffrey, JoVE, 2012, un protocole en vidéo).

Là où le jeu triche un peu

• L’étiquette. Tu commences avec la protéine native et trois colonnes, et tu gagnes l’étiquette histidine plus tard. La vraie UgpG avait une étiquette histidine dès le départ : une colonne de nickel et une colonne de dessalage, et le Bradford pour la doser.
• Les sites de restriction. La vraie UgpG a été clonée avec BamHI et HindIII ; les raisons du jeu pour ne pas utiliser EcoRI ou NotI sont inventées pour le jeu.
• La charge d’UgpG. L’indice du jeu sur la colonne d’échange d’ions à utiliser vient d’un pI inventé pour le jeu, pas d’un pI mesuré.
• Les prix et les durées. Les prix du matériel, les montants des financements et la plupart des durées sont des chiffres ronds de jeu. Le vrai matériel coûte plus cher, et les vrais financements prennent plus de temps.
• La lumière polarisée. Dans le jeu, les cristaux de sel s’allument et les cristaux de protéine à peine. La réalité est moins nette : beaucoup de cristaux de protéine brillent aussi entre polariseurs croisés, et les cristaux de sel cubiques, non.
• L’optimisation. Associer une méthode à une sorte de cristal marche bien plus proprement ici qu’à une vraie paillasse, où les cristallographes essaient surtout tout et gardent le cahier de labo à portée de main.
• L’autoinduction. Les vrais milieux d’autoinduction (les recettes de F. William Studier) sont plus riches que du LB avec trois sucres en plus ; le jeu garde le LB et ajoute les sucres en un seul pot.
• Les grilles. Le vrai contrôle des grilles regarde des centaines de carrés, puis les trous à l’intérieur ; le jeu montre un seul atlas et quatre choix. Depuis, de petites protéines ont été résolues par cryo-EM, avec des astuces (fusions, fragments d’anticorps).
• La renaturation. Comme dans l’article de 2009, AlgE passe dans l’urée 8 M et est ajoutée goutte à goutte à un tampon avec détergent, mais l’article faisait aussi d’abord passer une colonne de nickel en urée, puis agitait les gouttes toute la nuit à 37 °C : une vraie renaturation prend une nuit, pas une demi-minute.
• Les détergents. Le jeu en propose trois, dont un seul est le bon. Les vrais labos en criblent beaucoup, et le Triton X-100 a ses fans.
• La phase cubique. Un vrai mélange demande une centaine de passages ; le jeu en compte une vingtaine. Ses seringues chauffent aussi bien plus vite que les vraies, pour que la glace ait son tour. Le côté froid est réel : en dessous d’environ 18 °C, la monooléine devient lentement cireuse, ce qui explique en partie pourquoi les plaques de DgkA en chambre froide utilisaient un lipide plus court, la 7.8 MAG.
• Ouvrir les plaques. Un vrai puits met plus d’une demi-minute à s’ouvrir, et un coupe-verre s’émousse après une dizaine.
• Les gènes et le temps de DgkA. Dans le jeu, les gènes arrivent déjà dans le vecteur ; l’article dit qu’ils ont été faits sur commande et clonés dedans, sans dire par qui. Ses cristaux ont mis 45 à 60 jours en chambre froide ; le jeu en fait environ six semaines.
• Membranes ou corps d’inclusion. La part d’AlgE qui va où à chaque température est un chiffre de jeu.
• Les récepteurs. L’article sur le β2AR était une collaboration entre plusieurs labos, dont ceux de Brian Kobilka et de Martin Caffrey ; dans le jeu, tu fais toutes les étapes toi-même. Le balayage a 40 puits au lieu de 318, et le médicament radioactif se montre par une lueur. Les comptages de cellules, l’infection et les jours de récolte sont des chiffres de jeu : les méthodes des articles ne les donnent pas. Les vraies cellules Sf9 mettent environ un jour à doubler, plus lentement que dans le jeu.
• Le labo du chef d’équipe. Les instituts, les chefs d’équipe rivaux et l’équipe sont inventés, et leurs noms sont des blagues. Les projets avancent par semaines de travail partagées entre les gens qui sont dessus, ce qui est très loin de la façon dont la science avance vraiment, et les financements sont décidés bien plus vite que les vrais. Les idées de projets (l’enzyme préférée d’une chaussette qui pue, le levain immortel du labo) sont surtout là pour s’amuser, et une machine ne rend pas vraiment un article deux fois plus célèbre. Se faire griller, ça arrive, mais rarement à cause d’une seule longue soirée au bar d’un congrès.