Rato de Laboratório: Fábrica de Proteínas

Uma homenagem a quatro jogos do ZX Spectrum. Millionaire (John Hunt, Incentive Software, 1984) punha-nos a escrever e a vender jogos a partir do quarto, com 500 libras: repartiam-se 20 pontos entre programação, apresentação, ideias originais e interesse para o jogador, viam-se as vendas todos os meses, e o Honest Harry oferecia negócios que tanto podiam ser pechinchas como sarilhos. Cookie (Ultimate Play the Game, 1983) tinha o Charlie, o cozinheiro, a atirar ingredientes fugidos para uma tigela enquanto um monstro do caixote do lixo lá deitava lixo. Aqui está no primeiro ano de doutoramento: os 20 pontos vão para as etapas de bancada em que gostava de ter ajuda, o mês acaba com um relatório, o seu canto de uma bancada partilhada cresce até ser o melhor lugar do laboratório, e os vendedores (o Toni das Pontas e companhia) são primos do Honest Harry. O meio de cultura é a tigela. E, como em Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985), o jogo de submarinos por trás do Beamline Commander, anda entre as salas do laboratório (bancada, gabinete, catálogo, biblioteca, cozinha) como o comandante entre os postos de um submarino. A etapa de chefe de grupo junta-lhes Football Manager (Kevin Toms, Addictive Games, 1982): um plantel com classificações e energia, mudanças no fim de cada época, contratações e contas por equilibrar. Aqui o plantel é o seu laboratório, e ninguém é vendido nem despedido.

Acabe o doutoramento (cristais entregues, em qualquer nível) e abre-se o pós-doc: um laboratório mais bem equipado numa universidade melhor (um instituto de topo, depois de um doutoramento brilhante), um contrato de três anos e uma proteína de membrana. O final é uma entrevista para um lugar de professor: com cristais e um artigo seu, chega a vez do júri (no nível Médio, depois de duas proteínas de pós-doc; no Difícil, de três), e as respostas certas valem um lugar de docente. Cada etapa acabada fica no seu registo; outro doutoramento, ou o pós-doc, começa com os truques que aprendeu e os livros que leu, nunca com o material. Acabe um pós-doc e abre-se a etapa de chefe de grupo: cinco anos com um laboratório seu, num instituto cujo nome soa estranhamente familiar, um pacote de arranque que depende de como correu o pós-doc (talvez com a direcção do departamento) e uma equipa para construir. Cada pessoa tem nove pontos fortes (criatividade, ideias novas, mão para a bancada, análise, escrita, despacho, ensino, trabalho em equipa, comunicação), cada um com o seu tecto (ninguém se torna super-herói), além de energia, bem-estar, foco e laços com o laboratório. Contrata por anúncio ou vai buscar estrelas em ascensão aos laboratórios rivais, põe as pessoas nos projectos que lhes servem os pontos fortes, tem conversas a dois regulares (sem elas as pessoas desligam-se; com elas ficam, mesmo quando um rival oferece mais), junta doutorandos a mentores de feitio compatível, faz promessas que é melhor cumprir, negoceia o salário nas renovações, lê o relatório mensal da gestão do laboratório, manda pessoas a cursos e fica contente quando partem para empregos maiores. O Rico Mbinante vende escritores de bolsas «garantidos» e contratos de manutenção baratos, e o Tó Tapa-Buracos manda estudantes e pós-docs a preço de saldo, sem os ver primeiro. As bolsas pagam os salários, os convites para palestras passam a palestras principais, e institutos melhores vêm fazer-lhe propostas. Todos os anos a direcção do instituto marca objectivos (artigos, bolsas, entregas às linhas de luz, uma equipa contente), e no fim dos cinco anos um painel de avaliação olha para eles: uma nota que chegue (e um artigo) mantém o laboratório aberto; poucos objectivos cumpridos, ou três meses enterrados em dívidas, e fecha. As ideias para novos projectos vêm da equipa, das pessoas que conhece, de antigos membros do laboratório e de máquinas novas, e algumas trazem um rival em corrida pelo mesmo artigo. Os projectos precisam do material certo (sem ele a equipa pede emprestado, e anda devagar), e um microscópio confocal ou uma medição de ligação pode levar um artigo a uma revista de topo. Todas as semanas escolhe um plano: a bancada com a equipa (com um momento prático seu), uma semana de escrita, reuniões, ou a carta da semana (um seminário, um painel de bolsas, os serviços financeiros). Uma vez em cinco anos alguma coisa grande corre mal (um corte no financiamento, uma inundação, uma nova direcção de departamento egoísta, uma fuga de informação), e às vezes alguma coisa grande corre bem. Depois de cada palestra, no pós-doc ou como chefe de grupo, há perguntas da sala (uma fácil, uma média e uma difícil) e depois o jantar do congresso, onde uma noite longa no bar pode ensinar-lhe um segredo, custar-lhe um, ou acabar em romance. Escolha quem é o seu rato de laboratório: ela, ele, ou neutro (sem palavras com género).

Como num laboratório a sério, quem está a fazer o doutoramento não tem as bolsas grandes: ajuda a orientadora a escrever as dela (uma parte vem para o seu projecto) e quem está no pós-doc com um pedido de equipamento (a máquina que o pedido traz também é sua para usar), e de vez em quando alguém do doutoramento pede uma mão, o que pode acabar num artigo com o seu nome. Os laboratórios também são pessoas: uma fase em baixo, uma paixoneta no laboratório, uma zanga por espaço na bancada, um erro que ninguém viu. Falar com alguém, pedir com jeitinho e dar a mão à palmatória ajudam sempre, e a biblioteca tem um livro (tonto) para cada caso.

No doutoramento leva pósteres aos congressos (um bom pode ganhar o prémio de melhor póster); no pós-doc dá palestras curtas, escreve mais artigos, entra na associação de pós-docs, e pode pagar a um técnico durante uns meses quando há menos tempo do que dinheiro. As coisas pequenas acabam-se (géis pré-feitos, células competentes boas, suplementos de autoindução), por isso fique de olho na prateleira. Os níveis mais difíceis valem mais: a reputação vem mais depressa e a pontuação final conta mais. No pós-doc também se podem experimentar grelhas de crio-EM, e perceber porque é que uma proteína de membrana pequena é trabalho para cristais. Os artigos ganham citações mês a mês (as vendas do Millionaire), um comunicado de imprensa pode dar uma entrevista no jornal ou na televisão, e os dias abertos e as sessões sobre carreiras só custam tempo.

A ciência

• A proteína. A UgpG, de Sphingomonas elodea, a bactéria que faz a goma gelana. Junta glucose-1-fosfato a UTP para fazer UDP-glucose, um dos blocos de construção da goma. Foi a proteína do doutoramento do David: clonagem, expressão, purificação e cristalização (Acta Crystallographica F, 2006) e a sua estrutura (Journal of Bacteriology, 2007).

• A clonagem. Uma PCR copia o gene, enzimas de restrição cortam-no a ele e a um vector, e o novo plasmídeo entra em E. coli. As colónias que crescem em ampicilina têm-no, menos as pequeninas colónias satélite à volta delas, que vivem onde a colónia grande já destruiu o antibiótico. O plasmídeo volta a sair com uma miniprep (antigamente com fenol e clorofórmio) e é sequenciado.

• Crescimento e expressão. O meio LB (triptona, extracto de levedura, sal) vai à autoclave; depois disso, os germes só podem entrar de fora. A curva de crescimento tem uma fase de latência, uma fase exponencial e um patamar, e o IPTG liga o gene através do operão lac. Feita depressa demais, a proteína não faz bem o folding e acaba em corpos de inclusão.

• A purificação. As colunas separam as proteínas pela carga (troca iónica), pelo quão gordurosa é a superfície (interacção hidrofóbica, um dos tipos de cromatografia), pelo tamanho (exclusão molecular) ou por uma cauda de histidinas em níquel. O ensaio de Bradford mostra onde há proteína, qualquer proteína; o SDS-PAGE mostra qual é a banda da sua.

• Antes dos cristais. A dispersão dinâmica de luz (DLS) apanha agregados, e um ensaio de desvio térmico encontra o tampão de que a proteína gosta.

• Os cristais. Cristalização de proteínas por difusão de vapor: rastreios de condições, hits, optimização, e depois congelar com um crioprotector para a linha de luz. A selenometionina no lugar da metionina junta um sinal que ajuda a resolver a estrutura, e uma série cuidadosa de concentrações num tampão igual faz uma amostra para SAXS.

• A proteína do pós-doc. A AlgE, o poro da membrana externa de Pseudomonas aeruginosa que deixa sair o alginato para os seus biofilmes: um barril beta na membrana externa bacteriana. É uma proteína de membrana, gordurosa onde toca nos lípidos, e os dois caminhos do jogo foram ambos publicados. Renaturação: a AlgE feita em corpos de inclusão, desnaturada em ureia e renaturada para detergente, e depois cristalizada em detergente (o método: Whitney et al., Acta Crystallographica F, 2009; a estrutura: Whitney et al., PNAS, 2011). Membranas: células crescidas a temperatura baixa, membranas sedimentadas numa ultracentrífuga, a AlgE tirada com o detergente suave octilglucósido (β-OG), trocado por LDAO numa coluna de cobre, e depois cristalizada na fase cúbica lipídica, primeiro em monoleíno e melhor num lípido mais curto, o 7.8 MAG (Tan et al., Acta Crystallographica D, 2014; o método: Caffrey e Cherezov, Nature Protocols, 2009). O gene entra por clonagem TOPO. O David ajudou a recolher e processar os dados das estruturas de 2014, a refiná-las e a resolver a estrutura: veja AlgE.

• A outra proteína do pós-doc. A DgkA, uma diacilglicerol cinase da membrana interna de E. coli: 121 aminoácidos, três cadeias a trabalhar em conjunto, a passar um fosfato do ATP para um lípido. O caminho no jogo é o publicado: o gene feito por encomenda no vector pTrcHisB, mutações estabilizadoras (a termoestável Δ4 e a desenhada Δ7), o lisado das células solubilizado no detergente Empigen BB e trocado numa coluna de níquel para decil maltósido, e depois cristais na fase cúbica lipídica com 7.8 MAG a 4 °C, que levaram semanas a crescer (Li et al., Nature, 2013). A substituição molecular falhou, por isso as fases vieram da selenometionina. Mais tarde, cristais embebidos num análogo do ATP não hidrolisável e em zinco apanharam-na a meio da reacção (Li et al., Nature Communications, 2015). O David fez parte da equipa dos dois artigos, do lado da cristalografia: veja DgkA.

• Os receptores do pós-doc. Dois receptores acoplados à proteína G (GPCRs), a família por trás do Prémio Nobel da Química de 2012 para Robert Lefkowitz e Brian Kobilka: sete hélices a atravessar a membrana, uma bolsa para o fármaco que muda de forma, e ansas desengonçadas que dificultam os cristais. Os dois são feitos em células de insecto (Sf9) infectadas com um baculovírus que leva o gene. O receptor adrenérgico β2 segue o artigo de 2011: lisozima do fago T4 metida na terceira ansa, a mais desengonçada, a mutação H93C para que um agonista desenhado fique agarrado de vez, uma coluna de anticorpo e uma coluna de alprenolol, e depois cristais minúsculos em monoleíno com colesterol (Rosenbaum et al., Nature, 2011); com o agonista inverso carazolol, repete-se uma estrutura anterior. O David é um dos autores do artigo de 2011: veja β2AR. O receptor adrenérgico β1 do peru é primeiro tornado mais robusto: um varrimento de alanina de 318 mutantes em E. coli, cada um aquecido e testado na ligação a um fármaco, e os seis melhores combinados, 21 °C mais estável (Serrano-Vega et al., PNAS, 2008); depois células de insecto e cristais em detergente por difusão de vapor (Warne et al., Nature, 2008), trabalho dos grupos de Chris Tate e Gebhard Schertler no MRC Laboratory of Molecular Biology.

• Os projectos do chefe de grupo. O KcsA, o canal de potássio bacteriano cuja estrutura (Doyle et al., Science, 1998) ajudou a dar a Roderick MacKinnon o Prémio Nobel da Química de 2003; a IL-33 agarrada por uma proteína de um verme intestinal, a HpARI2, feita em dois hospedeiros e estudada por cristais e SAXS (Jamwal et al., Nature Communications, 2024); a PTX3, o projecto-bandeira, por cristais, crio-EM e SAXS (Shah et al., Matrix Biology, 2025); e um rastreio de fragmentos, centenas de cristais embebidos para a I04.

• Os grandes projectos, mais para o fim dos cinco anos: venenos dos animais perigosos da Austrália, entre eles um péptido de uma aranha-de-teia-em-funil que protege o cérebro de ratos depois de um AVC (Chassagnon et al., PNAS, 2017); uma PETase mais rápida, a enzima que come plástico, estudada nas linhas de luz de MX do Diamond: a sua estrutura na I23, na I03 e na I04 (Austin et al., PNAS, 2018), a «super-enzima» PETase–MHETase na I03 (Knott et al., PNAS, 2020) e a HotPETase, evoluída para trabalhar a 70 °C, na I03, na I04 e na I04-1 (Bell et al., Nature Catalysis, 2022); enzimas para marés negras; um fármaco contra os mortíferos henipavírus; voltar a pôr os antibióticos a funcionar contra as β-lactamases e as bombas de efluxo; fármacos contra o cancro e a gripe desenhados a partir de estruturas, como o venetoclax e o oseltamivir (Tamiflu); e enzimas que fazem química em água à temperatura ambiente.

• O material do chefe de grupo. O de um laboratório de proteínas de membrana: uma sala de células de insecto, um robô de LCP e o LCP-FRAP (apaga-se com luz um ponto de proteína fluorescente na fase cúbica: se ele volta a acender, a proteína mexe-se e pode cristalizar ali), FSEC, um congelador de imersão e um robô de grelhas para crio-EM, e a expressão sem células para proteínas que matam o hospedeiro; e para o artigo, um microscópio confocal (para onde vai a proteína na célula), o SPR (com que força se liga) e a fotometria de massa (quantas cópias se juntam).

• Abrir as placas. Os cristais na fase cúbica lipídica crescem selados entre duas lâminas de vidro. Para os colher, riscam-se dois círculos no vidro de cima à volta do poço, parte-se o vidro entre eles e levanta-se o disco com uma pinça; os cristais pescam-se da mesofase pegajosa com um loop pequeno e vão directos para o azoto líquido, sem crioprotector (Li, Boland, Aragão, Walsh e Caffrey, JoVE, 2012, um protocolo em vídeo).

Onde o jogo faz um bocadinho de batota

• A cauda. Começa com a proteína nativa e três colunas, e só mais tarde ganha a cauda de histidinas. A UgpG verdadeira teve-a desde o início: uma coluna de níquel, uma coluna de dessalinização, e o Bradford para a medir.
• Locais de restrição. A UgpG verdadeira foi clonada com BamHI e HindIII; as razões do jogo para não usar EcoRI ou NotI são inventadas.
• A carga da UgpG. A pista do jogo sobre a coluna de troca iónica a usar vem de um pI inventado para o jogo, não de um medido.
• Preços e tempos. Os preços do material, as quantias das bolsas e a maior parte dos tempos são números redondos de jogo. O material verdadeiro é mais caro, e as bolsas verdadeiras demoram mais.
• Luz polarizada. No jogo os cristais de sal acendem-se e os de proteína quase não. A vida real é menos arrumada: muitos cristais de proteína também brilham entre polarizadores cruzados, e os cristais de sal cúbicos não.
• Optimizar. Escolher o método conforme o tipo de cristal funciona aqui muito mais certinho do que numa bancada a sério, onde os cristalógrafos experimentam quase tudo e têm o caderno de laboratório sempre à mão.
• Autoindução. Os meios de autoindução verdadeiros (as receitas de F. William Studier) são mais ricos do que LB com três açúcares por cima; o jogo fica com o LB e junta os açúcares num só frasco.
• Grelhas. O rastreio de grelhas a sério olha para centenas de quadrados e depois para os buracos dentro deles; o jogo mostra um atlas e quatro escolhas. Entretanto já se resolveram proteínas pequenas por crio-EM, com truques (fusões, fragmentos de anticorpos).
• Renaturação. Como no artigo de 2009, a AlgE vai para ureia 8 M e entra num tampão com detergente gota a gota, mas o artigo passou-a primeiro por uma coluna de níquel em ureia, e depois deixou as gotas a agitar durante a noite a 37 °C: a renaturação a sério leva uma noite, não meio minuto.
• Detergentes. O jogo oferece três e um está certo. Os laboratórios a sério testam muitos, e o Triton X-100 tem os seus fãs.
• A fase cúbica. A mistura a sério leva umas cem vezes de uma seringa para a outra; o jogo conta umas duas dúzias. As seringas também aquecem muito mais depressa do que as verdadeiras, para o gelo ter a sua vez. O lado frio é real: abaixo de uns 18 °C o monoleíno fica lentamente ceroso, o que é uma das razões por que as placas da DgkA na câmara fria usaram um lípido mais curto, o 7.8 MAG.
• Abrir as placas. Os poços a sério levam mais de meio minuto a abrir, e um corta-vidros perde o fio ao fim de uns dez.
• Os genes e o tempo da DgkA. No jogo os genes chegam já no vector; o artigo diz que foram feitos por encomenda e clonados nele, sem dizer por quem. Os cristais levaram 45 a 60 dias na câmara fria; o jogo arredonda para umas seis semanas.
• Membranas ou corpos de inclusão. Quanta AlgE vai para onde, a cada temperatura, é um número de jogo.
• Os receptores. O artigo do β2AR foi uma colaboração entre vários laboratórios, entre eles o de Brian Kobilka e o de Martin Caffrey; no jogo, cada passo é seu. O varrimento tem 40 poços em vez de 318, e o fármaco radioactivo aparece como um brilho. As contagens de células, a infecção e os dias de colheita são números de jogo: os métodos dos artigos não os dão. As células Sf9 verdadeiras levam cerca de um dia a duplicar, mais devagar do que as do jogo.
• O laboratório do chefe de grupo. Os institutos, os chefes de grupo rivais e a equipa são inventados, e os nomes são piadas (na versão portuguesa, com sotaque de cá). Os projectos avançam com semanas de trabalho repartidas pelas pessoas que estão neles, o que está muito longe de como a ciência anda de verdade, e as bolsas decidem-se muito mais depressa do que as verdadeiras. As ideias de projecto (a enzima preferida de uma meia malcheirosa, a massa-mãe imortal do laboratório) são sobretudo para rir, e uma máquina não torna mesmo um artigo duas vezes mais famoso. Há quem seja ultrapassado por um rival na corrida ao artigo, mas raramente por causa de uma noite longa no bar de um congresso.