Topo di laboratorio: Fabbrica di proteine

Un omaggio a quattro giochi dello ZX Spectrum. Millionaire (John Hunt, Incentive Software, 1984) ti faceva scrivere e vendere giochi dalla tua cameretta con 500 sterline: si distribuivano 20 punti tra programmazione, presentazione, idee originali e interesse per chi gioca, si guardavano le vendite ogni mese, e Honest Harry proponeva affari che potevano essere occasioni d’oro o guai. Cookie (Ultimate Play the Game, 1983) faceva correre Charlie, il cuoco, dietro a ingredienti in fuga per spedirli in una ciotola, mentre un mostro della pattumiera ci buttava dentro spazzatura. Qui cominci il dottorato: i 20 punti vanno alle tappe al bancone in cui ti farebbe comodo un aiuto, il mese finisce con un resoconto, il tuo angolo di un bancone condiviso diventa a poco a poco il posto migliore del laboratorio, e i venditori (Totò Puntali e compagnia) sono cugini di Honest Harry. Il terreno di coltura è la ciotola. E come in Silent Service (Sid Meier, MicroProse, 1985), il gioco di sottomarini dietro a Beamline Commander, ti sposti tra le stanze del laboratorio (bancone, ufficio, catalogo, biblioteca, cucina) come un comandante tra le postazioni di un sottomarino. La parte da capogruppo aggiunge Football Manager (Kevin Toms, Addictive Games, 1982): una rosa con voti ed energia, i cambiamenti a ogni fine stagione, il calciomercato e i conti da far quadrare. Qui la rosa è il tuo laboratorio, e nessuno viene venduto né licenziato.

Finisci il dottorato (cristalli consegnati, a qualsiasi livello) e si apre il postdoc: un laboratorio meglio attrezzato in un’università migliore (un istituto di punta, dopo un dottorato brillante), un contratto di tre anni e una proteina di membrana. Finisce con un colloquio per un posto di docenza: con i cristalli e un articolo tuo arrivi davanti alla commissione (a livello Medio, dopo due proteine da postdoc; a Difficile, tre), e le risposte giuste ti valgono il posto. Ogni parte conclusa resta nel tuo curriculum; un altro dottorato, o il postdoc, parte con i trucchi imparati e i libri letti, mai con le attrezzature. Finisci un postdoc e si apre la parte da capogruppo: cinque anni con il tuo laboratorio in un istituto dal nome stranamente familiare, un pacchetto di avvio che dipende da com’è andato il postdoc (magari con la direzione del dipartimento), e un gruppo da costruire. Ogni persona ha nove punti di forza (creatività, idee nuove, mano al bancone, analisi, scrittura, concretezza, insegnamento, lavoro di squadra, comunicazione), ognuno con il suo tetto (nessuno diventa un supereroe), più energia, benessere, concentrazione e un legame con il laboratorio. Assumi con gli annunci o attiri stelle nascenti dai laboratori rivali, metti le persone sui progetti adatti ai loro punti di forza, fai colloqui a tu per tu regolari (senza, le persone perdono la bussola; con, restano, anche quando un rivale offre di più), affianchi ai dottorandi una guida dal carattere compatibile, fai promesse che faresti bene a mantenere, tratti lo stipendio al rinnovo, leggi il rapporto mensile della gestione del laboratorio, mandi le persone ai corsi e fai il tifo quando se ne vanno verso lavori più importanti. Rico Mbinante vende scrittori di domande «garantiti» e contratti di manutenzione a buon mercato, e Gino Tappabuchi manda dottorandi e postdoc a prezzo stracciato, a scatola chiusa. I finanziamenti pagano gli stipendi, gli interventi su invito diventano keynote, e istituti più prestigiosi vengono a cercarti. Ogni anno il consiglio dell’istituto fissa degli obiettivi (articoli, finanziamenti, consegne alle linee di luce, un gruppo contento), e alla fine dei cinque anni una commissione di valutazione li esamina: un voto sufficiente (e un articolo) ti fa tenere il laboratorio; troppo pochi obiettivi raggiunti, o tre mesi sommersi dai debiti, e chiude. Le idee per i progetti vengono dal tuo gruppo, dalle persone che incontri, dagli ex membri del laboratorio e dalle macchine nuove, e alcune arrivano con un rivale in corsa con te fino all’articolo. I progetti hanno bisogno delle attrezzature giuste (senza, il gruppo se le fa prestare, piano piano), e un microscopio confocale o una misura di legame possono portare un articolo su una rivista di punta. Ogni settimana scegli un programma: il bancone con il gruppo (un momento pratico tutto tuo), una settimana di scrittura, le riunioni, o la carta della settimana (un seminario, una commissione di valutazione, l’amministrazione). Una volta in cinque anni qualcosa va molto storto (un taglio dei fondi, un allagamento, una nuova direzione di dipartimento egoista, una fuga di notizie), e a volte qualcosa va molto bene. Dopo ogni intervento, da postdoc o da capogruppo, arrivano le domande dal pubblico (una facile, una media e una difficile), poi la cena del congresso, dove una lunga serata al bar può insegnarti un segreto, costartene uno o finire in una storia d’amore. Scegli tu chi è il tuo topo di laboratorio: lei, lui o neutro (senza parole con il genere).

Come in un laboratorio vero, chi fa il dottorato non porta i finanziamenti grossi: aiuti la tua relatrice a scrivere i suoi (una parte arriva al tuo progetto) e un postdoc con una richiesta di attrezzature (la macchina che arriva la puoi usare anche tu), e ogni tanto qualcun altro del dottorato ti chiede una mano, il che può finire in un articolo con il tuo nome. I laboratori sono fatti anche di persone: un periodo no, una cotta in laboratorio, una lite per un posto al bancone, un errore che nessuno ha visto. Parlarne con qualcuno, chiedere con garbo e ammettere i propri sbagli aiuta sempre, e la biblioteca ha un libro (un po’ sciocco) per ogni caso.

Nel dottorato si portano poster ai congressi (uno buono può vincere il premio); da postdoc si tengono brevi interventi, si scrivono più articoli, si entra nell’associazione dei postdoc, e si può pagare un tecnico per un paio di mesi quando manca più il tempo dei soldi. Le piccole cose finiscono (gel precast, cellule competenti di quelle buone, supplementi per l’autoinduzione), quindi tieni d’occhio il ripiano. I livelli più difficili valgono di più: la reputazione arriva più in fretta e i punti finali contano di più. Da postdoc puoi anche provare le griglie per la crio-EM, e capire perché una piccola proteina di membrana è un lavoro per i cristalli. Gli articoli accumulano citazioni mese dopo mese (le vendite di Millionaire), un comunicato stampa può portare a un’intervista su un giornale o in TV, e gli open day e gli incontri sulle professioni costano solo tempo.

La scienza

• La proteina. UgpG, di Sphingomonas elodea, il batterio che produce la gomma gellano. Unisce il glucosio-1-fosfato all’UTP per fare l’UDP-glucosio, un mattone della gomma. Era la proteina del dottorato di David: clonaggio, espressione, purificazione e cristallizzazione (Acta Crystallographica F, 2006) e la sua struttura (Journal of Bacteriology, 2007).

• Il clonaggio. Una PCR copia il gene, gli enzimi di restrizione tagliano lui e un vettore, e il nuovo plasmide entra in E. coli. Le colonie che crescono con l’ampicillina lo portano, tranne le minuscole colonie satellite intorno, che vivono dove la colonia grande ha distrutto l’antibiotico. Il plasmide si recupera con una miniprep (un tempo con fenolo e cloroformio) e si fa sequenziare.

• Coltura ed espressione. Il terreno LB (triptone, estratto di lievito, sale) va in autoclave; da lì in poi i germi possono arrivare solo da fuori. La curva di crescita ha una fase di latenza, una fase esponenziale e un plateau, e l’IPTG accende il gene attraverso l’operone lac. Prodotta troppo in fretta, la proteina si ripiega male e finisce nei corpi di inclusione.

• La purificazione. Le colonne separano le proteine per carica (scambio ionico), per quanto sono unte (interazione idrofobica, uno dei tipi di cromatografia), per dimensione (esclusione molecolare) o grazie a una coda di istidine sul nichel. Il saggio di Bradford mostra dove c’è proteina, una qualsiasi; l’SDS-PAGE mostra quale banda è la tua.

• Prima dei cristalli. La diffusione dinamica della luce scova gli aggregati, e un thermal shift assay trova il tampone che piace alla proteina.

• I cristalli. La cristallizzazione delle proteine per diffusione di vapore: screening di condizioni, hit, ottimizzazione, poi il congelamento con un crioprotettore per la linea di luce. La selenometionina al posto della metionina aggiunge un segnale che aiuta a risolvere la struttura, e una serie accurata di concentrazioni in un tampone identico dà un campione per il SAXS.

• La proteina del postdoc. AlgE, il poro nella membrana esterna di Pseudomonas aeruginosa da cui esce l’alginato dei suoi biofilm: un barile beta nella membrana esterna dei batteri. È una proteina di membrana, unta dove tocca i lipidi, e le due strade del gioco sono entrambe pubblicate. La rinaturazione: AlgE prodotta nei corpi di inclusione, srotolata in urea e ripiegata in detergente, poi cristallizzata in detergente (il metodo: Whitney et al., Acta Crystallographica F, 2009; la struttura: Whitney et al., PNAS, 2011). Le membrane: cellule cresciute al fresco, membrane portate giù in un’ultracentrifuga, AlgE estratta con un detergente delicato, l’ottil glucoside, sostituito con l’LDAO su una colonna al rame, poi cristallizzata in fase cubica lipidica, prima nella monooleina e al meglio in un lipide più corto, la 7.8 MAG (Tan et al., Acta Crystallographica D, 2014; il metodo: Caffrey e Cherezov, Nature Protocols, 2009). Il gene entra con il clonaggio TOPO. David ha aiutato a raccogliere ed elaborare i dati delle strutture del 2014, ad affinarle e a risolvere la struttura: vedi AlgE.

• L’altra proteina del postdoc. DgkA, una diacilglicerolo chinasi della membrana interna di E. coli: 121 amminoacidi, tre catene che lavorano insieme e passano un fosfato dall’ATP a un lipide. La sua strada nel gioco è quella pubblicata: il gene fatto su ordinazione nel vettore pTrcHisB, mutazioni stabilizzanti (il Δ4 termostabile e il Δ7 progettato), il lisato delle cellule solubilizzato nel detergente Empigen BB e passato al decil maltoside su una colonna di nichel, e infine cristalli in fase cubica lipidica con la 7.8 MAG a 4 °C, che ci hanno messo settimane a crescere (Li et al., Nature, 2013). La sostituzione molecolare non ha funzionato, quindi le fasi sono venute dalla selenometionina. Più tardi, un soaking con un analogo dell’ATP non idrolizzabile e lo zinco l’ha colta a metà reazione (Li et al., Nature Communications, 2015). David faceva parte del gruppo dietro i due articoli, sul lato della cristallografia: vedi DgkA.

• I recettori del postdoc. Due recettori accoppiati a proteine G (GPCR), la famiglia dietro il premio Nobel per la chimica 2012 a Robert Lefkowitz e Brian Kobilka: sette eliche attraverso la membrana, una tasca per il farmaco che cambia forma, e anse molli che rendono difficili i cristalli. Entrambi si producono in cellule di insetto (Sf9) infettate da un baculovirus che porta il gene. Il recettore adrenergico β2 segue l’articolo del 2011: il lisozima del fago T4 nella sua terza ansa, quella molle, la mutazione H93C perché un agonista progettato si attacchi per sempre, una colonna con anticorpo e una colonna di alprenololo, poi cristalli minuscoli in monooleina con colesterolo (Rosenbaum et al., Nature, 2011); con il carazololo, un agonista inverso, rifai una struttura precedente. David è uno degli autori dell’articolo del 2011: vedi β2AR. Il recettore adrenergico β1 del tacchino viene prima reso più robusto: una scansione con alanina di 318 mutanti in E. coli, ognuno scaldato e provato sul legame con un farmaco, e i sei migliori riuniti, stabile 21 °C in più (Serrano-Vega et al., PNAS, 2008); poi cellule di insetto e cristalli in detergente per diffusione di vapore (Warne et al., Nature, 2008), il lavoro dei gruppi di Chris Tate e Gebhard Schertler al MRC Laboratory of Molecular Biology.

• I progetti da capogruppo. KcsA, il canale del potassio batterico la cui struttura (Doyle et al., Science, 1998) ha aiutato Roderick MacKinnon a vincere il premio Nobel per la chimica 2003; l’IL-33 afferrata da una proteina di un verme intestinale, HpARI2, prodotte in due ospiti e studiate con cristalli e SAXS (Jamwal et al., Nature Communications, 2024); PTX3, il progetto di punta, con cristalli, crio-EM e SAXS (Shah et al., Matrix Biology, 2025); e uno screening di frammenti, centinaia di cristalli immersi per la I04.

• I grandi progetti, più avanti nei cinque anni: i veleni degli animali pericolosi dell’Australia, tra cui il peptide di un ragno dalla tela a imbuto che protegge il cervello dopo un ictus nei ratti (Chassagnon et al., PNAS, 2017); una PETasi più veloce, l’enzima mangiaplastica studiato sulle linee MX di Diamond: la sua struttura sulla I23, la I03 e la I04 (Austin et al., PNAS, 2018), il «super-enzima» PETasi–MHETasi sulla I03 (Knott et al., PNAS, 2020) e la HotPETasi, evoluta per lavorare a 70 °C, sulla I03, la I04 e la I04-1 (Bell et al., Nature Catalysis, 2022); enzimi contro le maree nere; un farmaco contro i temibili henipavirus; rimettere al lavoro gli antibiotici contro le beta-lattamasi e le pompe; farmaci contro il cancro e l’influenza progettati a partire dalle strutture, come il venetoclax e l’oseltamivir (Tamiflu); e enzimi che fanno chimica in acqua, a temperatura ambiente.

• Le attrezzature da capogruppo. Come quelle di un laboratorio di proteine di membrana: una stanza per le cellule di insetto, un robot per LCP e il LCP-FRAP (si sbianca un punto di proteina fluorescente nella fase cubica: se torna a brillare, la proteina lì può cristallizzare), la FSEC, un congelatore a immersione e un robot per griglie per la crio-EM, l’espressione cell-free per le proteine che uccidono il loro ospite; e per l’articolo, un microscopio confocale (dove va la proteina nella cellula), la SPR (quanto forte si lega) e la fotometria di massa (quante copie stanno insieme).

• Aprire le piastre. I cristalli in fase cubica lipidica crescono sigillati tra due lastrine di vetro. Per raccoglierli si incidono due cerchi nel vetrino intorno al pozzetto, si rompe il vetro tra i due e si solleva il disco con le pinzette; i cristalli si pescano dalla mesofase appiccicosa con un piccolo loop e vanno dritti nell’azoto liquido, senza crioprotettore (Li, Boland, Aragão, Walsh e Caffrey, JoVE, 2012, un protocollo in video).

Dove il gioco bara un po’

• La coda. Cominci con la proteina nativa e tre colonne, e la coda di istidine te la guadagni più tardi. La vera UgpG aveva la coda di istidine fin dall’inizio: una colonna di nichel e una di desalting, e il Bradford per misurarla.
• I siti di restrizione. La vera UgpG è stata clonata con BamHI e HindIII; i motivi del gioco per non usare EcoRI o NotI sono inventati.
• La carica di UgpG. L’indizio del gioco su quale colonna a scambio ionico usare viene da un pI inventato per il gioco, non da uno misurato.
• Prezzi e tempi. I prezzi delle attrezzature, le cifre dei finanziamenti e quasi tutti i tempi sono numeri tondi da gioco. Le attrezzature vere costano di più, e i finanziamenti veri ci mettono di più.
• La luce polarizzata. Nel gioco i cristalli di sale si accendono e quelli di proteina quasi per niente. La realtà è meno ordinata: molti cristalli di proteina brillano anche tra polarizzatori incrociati, e i cristalli di sale cubici no.
• L’ottimizzazione. Abbinare un metodo a un tipo di cristallo qui funziona molto più pulito che a un bancone vero, dove i cristallografi per lo più provano tutto e tengono il quaderno di laboratorio a portata di mano.
• L’autoinduzione. I veri terreni per l’autoinduzione (le ricette di F. William Studier) sono più ricchi dell’LB con tre zuccheri in più; il gioco tiene l’LB e aggiunge gli zuccheri in un solo barattolo.
• Le griglie. Il vero controllo delle griglie guarda centinaia di quadrati e poi i buchi al loro interno; il gioco mostra un solo atlante e quattro scelte. Da allora, piccole proteine sono state risolte con la crio-EM, con qualche trucco (fusioni, frammenti di anticorpo).
• La rinaturazione. Come nell’articolo del 2009, AlgE va in urea 8 M e viene aggiunta goccia a goccia a un tampone con detergente, ma l’articolo prima passava anche una colonna di nichel in urea, poi agitava le gocce tutta la notte a 37 °C: una vera rinaturazione richiede una notte, non mezzo minuto.
• I detergenti. Il gioco ne offre tre e uno è quello giusto. I laboratori veri ne provano molti, e il Triton X-100 ha i suoi tifosi.
• La fase cubica. Una vera miscelazione richiede un centinaio di passaggi; il gioco ne conta un paio di dozzine. Le sue siringhe si scaldano anche molto più in fretta di quelle vere, perché il ghiaccio abbia il suo momento. Il lato freddo è reale: sotto i 18 °C circa la monooleina diventa piano piano cerosa, ed è uno dei motivi per cui le piastre di DgkA in cella fredda usavano un lipide più corto, la 7.8 MAG.
• Aprire le piastre. Un pozzetto vero ci mette più di mezzo minuto ad aprirsi, e un tagliavetro perde il filo dopo una decina.
• I geni e i tempi di DgkA. Nel gioco i geni arrivano già nel vettore; l’articolo dice che sono stati fatti su ordinazione e clonati lì, senza dire da chi. I suoi cristalli ci hanno messo dai 45 ai 60 giorni in cella fredda; il gioco ne fa circa sei settimane.
• Membrane o corpi di inclusione. Quanta AlgE va dove a ogni temperatura è un numero da gioco.
• I recettori. L’articolo sul β2AR è stato una collaborazione tra diversi laboratori, tra cui quelli di Brian Kobilka e Martin Caffrey; nel gioco fai tu ogni passaggio. La scansione ha 40 pozzetti invece di 318, e il farmaco radioattivo si vede come un bagliore. I conteggi delle cellule, l’infezione e i giorni di raccolta sono numeri da gioco: i metodi degli articoli non li danno. Le vere cellule Sf9 ci mettono circa un giorno a raddoppiare, più lentamente che nel gioco.
• Il laboratorio da capogruppo. Gli istituti, i capigruppo rivali e il gruppo sono inventati, e i loro nomi sono battute. I progetti avanzano per settimane di lavoro divise tra le persone che ci lavorano, cosa molto lontana da come va davvero la scienza, e i finanziamenti si decidono molto più in fretta di quelli veri. Le idee per i progetti (l’enzima preferito di un calzino puzzolente, il lievito madre immortale del laboratorio) sono soprattutto per divertirsi, e una macchina non rende davvero un articolo due volte più famoso. Farsi bruciare sul tempo succede, ma raramente per colpa di una sola lunga serata al bar di un congresso.